一、原理
（一）什么是熒光，簡單地講，當用一定波長的光（如紫外光）照射某種物質(zhì)時，經(jīng)過照射的物質(zhì)在極短時間內(nèi)即可發(fā)射出一種可見的光，這種光即為熒光。
在生物中，由于產(chǎn)生熒光的方式不同，可以概括地歸納為以下幾種：
1． 自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光（或直接熒光）。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光。
2． 次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線照射后，并不能發(fā)出熒光，但是當它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光，這種稱為次生熒光（或間接熒光）。如吖啶橙，DAPI均可檢測細胞內(nèi)的核酸。
3． 免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應的原理，將熒光染料與抗體結合，然后，將這種標記熒光染料的抗體再與相應抗原結合，即形成抗原、抗體復合物。經(jīng)一定波長的光激發(fā)后，即可發(fā)射出熒光，以此辨認抗原在組織細胞內(nèi)的分布狀況。這種方法被稱為免疫熒光（或熒光抗體法）。
組織和細胞中所產(chǎn)生的熒光，須借助熒光顯微鏡方可進行觀察，本實驗是用普通顯微鏡配以一種輕便的熒光光源觀察熒光現(xiàn)象。
（二）輕便落射光裝置
落射光裝置的組成：此裝置是為普通顯微鏡配套設計的。它是由兩部分組成，一為光源；另一為落射光系統(tǒng)，如圖，落射光系統(tǒng)由激發(fā)濾片組成。當光線通過激發(fā)濾片到達二向分光鏡時，使激發(fā)光反射，經(jīng)物鏡后，激發(fā)標本，標本輻射熒光，又通過物鏡，分光鏡而到達目鏡，以供觀察者觀察及記錄。
二、目的與要求
初步了解生物熒光及熒光染色法，學習幾種生物熒光標本的制作與觀察。
三、實驗內(nèi)容
（一）生物自發(fā)熒光的觀察
（二）生物的熒光染色法
（三）熒光抗體法
四、實驗步驟
（一）生物自發(fā)熒光的觀察
1. 制片
（1）取一干凈載玻片
（2）用吸管吸取眼蟲培養(yǎng)物，滴于載玻片的中央位置。
（3）用鑷子取一張蓋玻片，沿液體的邊緣輕輕的蓋上蓋玻片。
（4）用吸水紙將蓋玻片周邊的多余水吸掉。
2. 觀察
（1）將載玻片置于顯微鏡載物臺上。
（2）調(diào)節(jié)好光源。可觀察。注意眼蟲的葉綠體呈現(xiàn)何種顏色？
（二） 吖啶橙染色法
吖啶橙是一種經(jīng)常使用的熒光染料，它對細胞中的DNA和RNA可同時染色，但顯示的顏色卻是有差異的。DNA呈綠色熒光，RNA呈桔紅色。
1． 制片
（1）取一干凈載玻片，滴一小滴蛋白膠于載玻片上，涂均勻。稍干。
（2）吸取四膜蟲培養(yǎng)液，滴于載玻片中央，待培養(yǎng)液似干未干時，滴加Carnoy’s液固定蟲體5－10分鐘。
（3）將載玻片放入70％酒精中，停留1－2分鐘，然后轉入蒸餾水中。
（4）取出載玻片，吸出載玻片上多余水份，轉入1％冰醋酸中，停留30秒－1分鐘，再轉入蒸餾水。
（5）將載片放入0.1％吖啶橙液（pH4.8～6.0）中，染色1－3分鐘。
（6）將載玻片放入PBS（pH6.0）液中。
（7）將載玻片放入0.1MCaCl中，分化30秒－2分鐘。
（8）轉入PBS液中。換3次，每次2－3分鐘。
（9）在標本處，滴加PBS－甘油液，輕輕加上蓋玻片。
2． 觀察
（1） 用吸水紙，吸去載玻片上多余的水份。
（2） 將標本置于顯微鏡載物臺上，調(diào)好光源。即可觀察。在顯微鏡下，細胞中DNA部位呈黃綠色（細胞核），RNA呈桔紅色（細胞質(zhì)及核仁）。
（三） 熒光抗體法
熒光抗體染色法，根據(jù)染色步驟的不同，分為兩種。一種為直接染色法，就是將熒光素直接與*抗體結合，然后，進行抗原抗體反應。另一種為間接染色法，就是將熒光素與第二抗體結合。此法需進行兩次抗原、抗體反應。
本實驗選用的是間接染色法，反應所用一抗為免抗四膜蟲抗體。二抗為羊抗兔FITC抗體，具體操作步驟如下：
1． 制片
（1） 固定細胞
①取一干凈載玻片，畫定樣品區(qū)域（直徑0.5cm圓圈），加四膜蟲，風干。
②待涂片似干未干時，滴加丙酮：乙醇（1：1）液，固定細胞5～10分鐘。
③將載玻片放入PBS液中，經(jīng)過3次，每次3－5分鐘。
（2） *步抗原－抗體反應
①將載玻片上多余的水擦干，取10ml二抗滴于標本上，放于濕皿內(nèi)，置于37°C，溫育40分鐘。
②取出玻片，經(jīng)PBS液洗3－5次。每次各5分鐘。
（3） 第二步抗原、抗體反應
①取10～20ml二抗滴于標本上，放于濕皿內(nèi)，置于37°C，溫育40分鐘。
②取出載玻片，經(jīng)PBS液洗3～5次，每次各5分鐘。
（4） 封片
將載玻片上多余的水份擦干，在標本處滴一小滴PBS：甘油液，輕輕加上蓋玻片。
2． 觀察
（1） 吸去邊緣多余液體，將載玻片放在顯微鏡載物臺上。
（2） 調(diào)好光源即可觀察。FITC熒光色素呈黃綠色熒光，觀察你的標本中，在細胞的哪些部位有陽性反應。
五、實驗用品
（一）實驗材料：眼蟲、四膜蟲、兔
（二）試劑：0.1％吖啶橙染色液，PBS（pH6.0）液，1％醋酸，0.1MCaCl2、蛋白膠、蒸餾水、甘油、PBS（1：9）液，抗體（一抗及二抗），70％酒精，卡氏固定液，乙醇丙酮（1：1）固定液。
（三）器皿：顯微鏡、輕便熒光光源、載玻片、蓋玻片、鑷子、染色缸6個、培養(yǎng)皿（9.5cm）5個、培養(yǎng)皿（12.5cm）/個。
當前位置：
更新時間：2013-06-18
點擊次數(shù)：1993
