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ELI-SPOT 及其應用
更新時間：2013-06-19
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一、 原理
ELI-SPOT，即斑點ELISA，是利用酶標板作反應容器進行的酶聯免疫反應。其基本原理與ELISA相同。首先用捕獲抗體包被反應板，封閉后，依次加入待檢標本、生物素化檢測抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物，陽性結果出現斑點顯色，利用倒置顯微鏡進行斑點計數。其優勢在于可在與體內（活體條件）極接近的條件下，在體外對細胞分泌成分（如細胞因子、Fas等）進行追蹤研究。
幾點說明：
l 反應板：ELI-SPOT所用的反應板可以是PVDF膜包被好的，也可以是普通酶標板。如用普通酶標板，需用特制的瓊脂糖底物溶液。因此，ELI-SPOT又可分為PVDF法和瓊脂糖法。
l 待檢標本須制成單細胞懸液，細胞經適當誘導劑刺激后產生相應的因子。
l 細胞誘導方法：細胞誘導可分為直接法和間接法。如果細胞誘導過程是在抗體包被的反應孔內進行的，即為直接法；如果細胞誘導過程是在24孔板或燒杯中進行的，即為間接法。采用直接法還是間接法取決于以下幾個方面：?待分析細胞的類型。‚預期的能分泌細胞因子的細胞數。如果預期的可分泌細胞因子的細胞量少，建議使用直接法；如果可分泌細胞因子的細胞量特別高，用間接法。
l 誘導劑及誘導時間的選擇：與待檢因子種類相關，參照下表（廠家提供，僅供參考）
| 待檢因子 | 樣本來源 | 誘導劑 | 誘導時間 | 檢測用細胞量 |
| Human IL-2 | PBMC | PMA, Ionomycin | 10-15 hours | 5x104-1x105 |
| Human IL-4 | CD4+ T細胞 | PMA, Ionomycin | 10-15 hours | 2x105-2.5x105 |
| Human IL-6 | PBMC | LPS | 10-15 hours | 1x104-2.5x104 |
| Human IL-10 | PBMC | LPS | 20-24 hours | 2x105-2.5x105 |
| Human IL-12 | PBMC | LPS | Overnight | 1x105-2.5x105 |
| Human IFN-γ | PBMC | PMA, Ionomycin | 10-15 hours | 2x104-5x104 |
| Human TNF-α | PBMC | LPS | 10-15 hours | 2x104-4x104 |
| Human Fas L | PBMC | Anti-human CD3 （B-B11）, IL-2, / PMA,Ionomycin | 3days,10-15 hours | 3x105-4x105 |
| Murine IFN-γ | PBMC | PMA, Ionomycin | 10-15 hours | 2x104-5x104 |
| Rat IFN-γ | PBMC | PMA, Ionomycin | 10-15 hours | 2x104-5x104 |
| Rat TNF-α | Rat splenocyte | LPS | 10-15 hours | 2x104-4x104 |
二、 ELI-SPOT 操作步驟
A：PVDF法
1． 96孔PVDF包被板經70%已醇處理后，用捕獲抗體進行包被。
2． 單細胞懸液（含適當誘導劑）加入反應孔內，孵育（直接法）；如用間接法，細胞在24孔板或燒杯中誘導后，取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內。
3． 倒掉細胞，加入生物素化檢測抗體，孵育。
4． 加鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5． 加入BCIP/NBT底物，形成斑點。
B：瓊脂糖法
1． 用捕獲抗體包被酶標板。
2． 單細胞懸液（含適當誘導劑）加入反應孔內，孵育（直接法）。如用間接法，細胞在24孔板或燒杯中誘導后，取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內。
3． 倒掉細胞，加入生物素化檢測抗體，孵育。
4． 鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5． 加入瓊脂糖底物溶液，形成斑點。
三、 ELI-SPOT 檢測單細胞分泌細胞因子的意義
細胞因子是一類由白細胞和其它一些細胞產生的，可在細胞間進行信息傳遞。大多數細胞因子是生長或分化調節因子，通常在造血系統中發揮作用，同時發現其在腦、肌肉和內分泌器官間也存在相互作用，另外，還能誘導細胞凋亡。在一些疾病中，如急性炎癥、血液病、癌癥和自身免疫性疾病中可常見細胞因子的異常表達。
在單細胞水平進行細胞因子的監測提供了zui接近“原位”環境的，即zui接近體內條件，觀察細胞因子產生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體外進行與體內環境相似的研究。利用這一方法，可跟蹤細胞因子的產生、跟蹤疾病進展、調整臨床治療策略、防止病情惡化以及致命后果的發生。
四、 ELI-SPOT應用
1． 在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中，給大鼠注射干擾素β后，可顯著隆低可產生干擾素γ的細胞的數量。（1）
2． 進行免疫基因肽疫苗的評價。（2）
3． 接種途徑效果的評估。（3）
4． 研究TH1/TH2 T細胞產生細胞因子的方式以及由一個亞群向另一個亞群轉換的情況。（4，5）
5． 成功檢測黑色素瘤中腫瘤活性T細胞數量。（6）
6． 用于重癥肌無力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細胞的研究。（7）
五、 參考文獻：
1． Ruuls, S.R. et al., 1996 J. Immunol. 157:5721
2． Kulane, A. et al., 1997 Acta Tropica. 68:37
3． Ibsen, M. W. et al., 1997 Scand. J. Immunol. 46:274
4． Gabrielsson, S. et al., 1997 Allergy. 52:860
5． Elaghazali, G. et al., 1997 Clin. Exp. Immunol. 109:84
6． Scheibenbogen, C. et al. 1997 Int. J. Cancer 71:932
7． 侯世芳，閆曉波，王維治，1999 第六屆全國神經免疫學術研討會論文匯編
